Процесс освоения региона был прерван в связи с агрессией Цинской империи. В 1644 году малочисленное племя маньчжуров, относящееся к тунгусской группе алтайской языковой семьи, жившее в южной части обширного региона, названного Маньчжурией, завоевало Китай, основав новую династию Цин. Разумеется, маньчжуры, только что покорившие Китай, с удивлением обнаружившие, что на границах их исконных земель появились какие-то новые пришельцы, немедленно начали боевые действия против них. Уже в 1652 году 2 тысячи хорошо вооруженных маньчжуров напали на отряд Е. Хабарова, зимовавшего в Ачинском остроге. Казаки разбили маньчжурское войско, потери которого составили 67 человек. Казаки потеряли 18 человек убитыми и 78 ранеными.
В 1655 году цинские войска, численностью до 10 тысяч человек, напали теперь на Кумарский острог, где зимовал отряд Онуфрия Степанова. Все их атаки казаки успешно отбили и цинские войска ушли восвояси. Через два года, летом 1657-го, маньчжуры на 47 судах напали на отряд О. Степанова на реке Сунгури. На этот раз они одержали победу, погибли О. Степанов и с ним 270 казаков и служилых людей. Собранный казаками ясак маньчжуры забрали себе. Убедившись в том, что русские казаки прекрасные воины, Цинский двор приступил к подготовке масштабных военных действий. Чтобы затруднить существование русских, он решил создать «мёртвую зону» на границе - стал выселять дючерское и даурское население из родных мест по Амуру и нижнему течению Сунгари в глубинные районы Манчжурии, а их улусы разорялись и сжигались. В результате и без того редкое население амурских земель почти полностью исчезло. Когда в середине XIX века в этих местах оказались русские переселенцы, то общее число амурских аборигенов не превышало нескольких тысяч человек.
Между тем, русско-маньчжурская война продолжалась. Весной 1685 года специально сформированная армия маньчжуров, насчитывавшая до 50 тысяч пеших воинов и до одной тысячи конницы, имевшая на вооружении 100 пушек, окружила русский город Албазин, где имелось всего 450 служивых людей, крестьян и купцов, 3 пушки и 300 мушкетов. Штурм Албазина продолжался несколько дней. Взять пылающий город маньчжуры не смогли, и были вынуждены пойти на переговоры. В результате перемирия, албазинцы выговорили себе право покинуть город и уйти в Нерчинск. После этого маньчжуры разрушили город, сожгли русские селения по Амуру, но посеянные хлеба не тронули. Это дало русским людям возможность вернуться и заново отстроить Албазин. С учетом прежнего опыта осады, они возвели вокруг города двойные деревянные стены, засыпав промежутки землей, создав высокий вал высотой 6 метров. К началу 1686 года в городе проживало более тысячи человек. Поскольку от маньчжурских походов страдало не только русское население Приамурья, но и коренное население, из их числа и под руководством местного князя Гантимура в 1687 году был создан совместный отряд.
Летом 1686 года маньчжурская армия численностью в 11 тысяч человек с 40 полевыми пушками вновь осадила Албазин. В городе было всего 1 220 человек, из них только 826 воинов, и 18 пушек. Несмотря на такое неравенство, албазинцы отражали натиск маньчжуров в течение полугода. К концу осады в живых остались лишь 150 защитников Албазина, но враг так и не смог овладеть городом. В конце концов, сложилась патовая ситуация - маньчжуры не могли взять Албазин, но и русские не смогли выгнать маньчжур. Посланная русским правительством в Китай русская миссия в октябре 1685 года достигла Пекина, и начались русско-китайские переговоры. Было достигнуто соглашение о прекращении осады Албазина и отводе маньчжурских войск с русской территории. Русская сторона обязалась не выходить на Амур для сбора ясака с местного населения.
Не имея возможности перебросить в Приамурье крупные военные силы, Россия подписала Нерчинский договор в 1689 году. Согласно территориальным статьям, российские подданные покидали левобережное Приамурье. Но вообще этот договор не устанавливал границу между Россией и Китаем в общепринятом смысле. Впрочем, берега Японского моря и острова Сахалин с Курилами вообще не упоминались в договоре. Точной границы между двумя государствами установлено не было. Огромный край, успешно осваивавшийся почти 40 лет, превращался в пустынную, почти не населённую, никому не принадлежавшую полосу. Длительная оборона Албазина навсегда вошла в историю героических подвигов русского народа. Но амурский вопрос на 250 лет остался нерешённым.
Если с амурскими землями возникли проблемы, то в северной части Дальнего Востока русские землепроходцы продолжали действовать весьма успешно. В 1697 году русские землепроходцы проникли на Камчатку. Практически одновременно русские промышленники начали масштабную добычу морского зверя в Беринговом и Охотском морях, исследуя Курильские и Алеутские острова, проникая на Аляску. Но, парадоксальным образом, на несравненно более благоприятные амурские земли русские вновь пришли значительнее позднее, уже в середине XIX столетия.
